Usando etiquetas fluorescentes que se encienden y apagan, Instituto de Tecnología de Massachusetts Los ingenieros pueden estudiar cómo interactúan las moléculas de una célula para controlar el comportamiento de la célula.

Las células vivas son bombardeadas con muchos tipos de señales moleculares entrantes que influyen en su comportamiento. La capacidad de medir esas señales y cómo las células responden a ellas a través de redes de señalización molecular puede ayudar a los científicos a aprender más sobre cómo funcionan las células, incluido lo que sucede a medida que envejecemos o desarrollamos enfermedades.

Actualmente, este tipo de estudios integrales no es posible porque las técnicas actuales de imágenes celulares se limitan a unos pocos tipos diferentes de moléculas dentro de una célula al mismo tiempo. Sin embargo, investigadores del MIT han desarrollado un método alternativo que les permite monitorear hasta siete moléculas diferentes simultáneamente, y quizás más.

Avance en imágenes moleculares

“Hay muchos ejemplos en biología en los que un evento desencadena una larga cadena de eventos, que luego conduce a una función celular específica”, dice Edward Boyden, profesor de neurotecnología de la Y. Eva Tan. “¿Cómo sucede eso? Podría decirse que es uno de los problemas fundamentales en biología, por lo que nos preguntamos: ¿podrías simplemente verlo suceder?”

El nuevo enfoque utiliza moléculas fluorescentes verdes o rojas que se encienden y apagan a diferentes velocidades. Al obtener imágenes de la célula en el transcurso de varios segundos, minutos u horas y luego extraer cada señal fluorescente usando un algoritmo matemático, se puede rastrear la cantidad de cada proteína objetivo a medida que cambia con el tiempo.

Utilizando cuatro fluoróforos conmutables, los investigadores del MIT pudieron etiquetar y obtener imágenes de cuatro quinasas diferentes dentro de estas células (cuatro filas superiores). En la fila inferior, el núcleo celular está resaltado en azul. Crédito: Cortesía de investigadores.

Boyden, también profesor de ingeniería biológica y ciencias cerebrales y cognitivas en el MIT, académico del Instituto Médico Howard Hughes, miembro del Instituto McGovern para la Investigación del Cerebro del MIT y del Instituto Koch para la Investigación Integrativa del Cáncer, así como codirector del K Lisa Yang Center for Bionics, es la autora principal del estudio, que se publicó el 28 de noviembre en la revista celúla. El investigador postdoctoral del MIT, Yong Qian, es el autor principal de este artículo.

Avances en señalización fluorescente

El etiquetado de moléculas dentro de las células con proteínas fluorescentes ha permitido a los investigadores aprender mucho sobre las funciones de muchas moléculas celulares. Este tipo de estudio a menudo se realiza utilizando la proteína verde fluorescente (GFP), que se publicó por primera vez para imágenes en la década de 1990. Desde entonces, se han desarrollado para uso experimental varias proteínas fluorescentes que brillan en otros colores.

Sin embargo, un microscopio óptico típico puede distinguir entre sólo dos o tres de estos colores, lo que permite a los investigadores sólo un vistazo a la actividad general que ocurre dentro de la célula. Si pueden rastrear una mayor cantidad de moléculas marcadas, los investigadores podrían medir la respuesta de las células cerebrales a diferentes neurotransmisores durante el aprendizaje, por ejemplo, o investigar las señales que impulsan la propagación de una célula cancerosa.

“Lo ideal sería poder observar las señales en la célula a medida que fluctúan en tiempo real, y luego entender cómo se relacionan entre sí. Esto le dirá cómo la célula realiza los cálculos”, afirma Boyden. es que no puedes ver muchas cosas al mismo tiempo”.

En 2020, el laboratorio de Boyden desarrolló una forma de obtener imágenes de hasta cinco moléculas diferentes dentro de una célula simultáneamente, apuntando a reporteros fluorescentes en diferentes ubicaciones dentro de la célula. Este enfoque, conocido como “multiplexación espacial”, permite a los investigadores distinguir señales de diferentes moléculas aunque todas ellas presenten fluorescencia en el mismo color.

En el nuevo estudio, los investigadores adoptaron un enfoque diferente: en lugar de distinguir señales según su ubicación física, crearon señales fluorescentes que variaban con el tiempo. Esta tecnología se basa en “fluoróforos conmutables”, que son proteínas fluorescentes que se encienden y apagan a una velocidad específica. En este estudio, Boyden y su equipo identificaron cuatro fluoróforos verdes conmutables y luego diseñaron dos más, todos los cuales se encienden y apagan a diferentes velocidades. También identificaron dos proteínas fluorescentes rojas que mutan a diferentes velocidades y diseñaron un fluoróforo rojo adicional.

Cada uno de estos fluoróforos conmutables se puede utilizar para marcar un tipo diferente de molécula dentro de una célula viva, como una enzima, una proteína de señalización o parte del citoesqueleto de la célula. Después de obtener imágenes de la célula durante varios minutos, horas o incluso días, los investigadores utilizan un algoritmo matemático para seleccionar la señal específica de cada fluoróforo, de forma similar a la forma en que el oído humano puede captar diferentes frecuencias de sonido.

“En una orquesta sinfónica, hay instrumentos de tono alto, como la flauta, e instrumentos de tono bajo, como la tuba. Y en el medio hay instrumentos como la trompeta. Todos tienen sonidos diferentes, y nuestros oídos los clasifican, ”Boyden dice.

La técnica matemática que utilizaron los investigadores para analizar las señales de los fluoróforos se conoce como mezcla lineal. Este método puede extraer diferentes señales de fluoróforo, de forma similar a la forma en que el oído humano utiliza un modelo matemático conocido como transformada de Fourier para extraer diferentes tonos de una pieza musical.

Una vez que se completa este análisis, los investigadores pueden ver cuándo y dónde se encontró cada una de las moléculas marcadas con fluorescencia en la célula durante todo el período de obtención de imágenes. La obtención de imágenes en sí se puede realizar utilizando un microscopio óptico simple, sin necesidad de equipo especializado.

Explorando fenómenos biológicos

En este estudio, los investigadores demostraron su enfoque marcando seis moléculas diferentes involucradas en el ciclo de división celular en células de mamíferos. Esto les permitió identificar patrones en cómo los niveles de enzimas llamadas quinasas dependientes de ciclina cambian a medida que la célula avanza a través del ciclo celular.

Los investigadores también demostraron que pueden clasificar otros tipos de quinasas, que participan en casi todos los aspectos de la señalización celular, así como en estructuras y orgánulos celulares, como el citoesqueleto y las mitocondrias. Además de sus experimentos utilizando células de mamíferos cultivadas en una placa de laboratorio, los investigadores demostraron que la técnica podría funcionar en los cerebros de larvas de pez cebra.

Según los investigadores, este método podría ser útil para monitorear cómo responden las células a cualquier tipo de entrada, como nutrientes, factores del sistema inmunológico, hormonas o neurotransmisores. También se puede utilizar para estudiar cómo responden las células a cambios en la expresión genética o mutaciones genéticas. Todos estos factores desempeñan papeles importantes en fenómenos biológicos como el desarrollo, el envejecimiento, el cáncer, la neurodegeneración y la formación de la memoria.

“Se puede pensar que todos estos fenómenos representan una clase general de problemas biológicos, donde un evento de corto plazo (como comer un nutriente, aprender algo o contraer una infección) desencadena un cambio a largo plazo”, dice Boyden.

Además de realizar este tipo de estudios, el laboratorio de Boyden también está trabajando para ampliar el depósito de fluoróforos conmutables para que puedan estudiar más señales dentro de la célula. También esperan adaptar el sistema para que pueda usarse en modelos de mouse.

Referencia: “Imágenes multiplexadas temporalmente de redes de señalización dinámica en células vivas” por Yong Qian, Orhan T. Selker, Zhiguan Wang, Burcu Güner-Ataman y Edward S. Boyden, 28 de noviembre de 2023, celúla.
doi: 10.1016/j.cell.2023.11.010

La investigación fue financiada por una beca Alannah y K. Lisa Yang, John Doerr, Jed McCaleb, James Fickell, Ashar Aziz y K. Lisa Yang y Hawke E. Tan Molecular Therapeutics en el Instituto de Tecnología de Massachusetts, el Instituto Médico Howard Hughes y el Institutos Nacionales de Salud.