En un estudio reciente publicado en virusLos autores introdujeron un método de transfección directa de plásmidos para producir partículas similares al virus (VLP) del SARS-CoV-2 en células de insectos y aplicaron VLP para evaluar la eficacia de los anticuerpos monoclonales (mAb) y el donante inmunizado. sueros

antecedentes

Las limitaciones de bioseguridad limitan la investigación con el virus SARS-CoV-2 original y, por lo tanto, se utilizan sistemas pseudovirales basados ​​en lentivirus o vesiculares (VSV). Sin embargo, las partículas PV resultantes expresan solo una de las proteínas estructurales del SARS-CoV-2[envoltura (E), punta (S), membrana (M) y nucleocápsida (N)]. ) y la nucleocápside (N) Además, la producción de energía fotovoltaica implica procesos complejos y requiere laboratorios de nivel de bioseguridad 2 (BSL2)[المغلف(E)،والسنبلة(S)،والغشاء(M)،والنيوكليوكابسيد(N)بالإضافةإلىذلك،يتضمنالإنتاجالكهروضوئيعملياتمعقدةويتطلبمختبراتمستوىالسلامةالحيوية2(BSL2)[envelope(E)spike(S)membrane(M)andnucleocapsid(N)InadditionPVproductioninvolvescomplexprocessesandrequiresbiosafetylevel2(BSL2)laboratories

Alternativamente, se pueden producir VLP que son similares a los virus nativos, se ensamblan espontáneamente en la coexpresión de la proteína SARS-CoV-2 y son seguros ya que carecen de datos genéticos y, por lo tanto, no pueden replicarse. Además, VLPS se puede producir en laboratorios BSL1. Las VLP de SARS-CoV-2 se producen típicamente en sistemas celulares basados ​​en BEVS (Sistema de vector de expresión viral bacteriano) que proporcionan un alto rendimiento de VLP y neutralización de SARS-CoV-2 en hámsters sirios. Por lo tanto, las BEVS-VLP se pueden usar como vacunas para la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19).

sobre estudiar

En este estudio, los investigadores generaron VLP de SARS-CoV-2 basadas en plásmidos en un sistema de células de insectos y las utilizaron para un ensayo citológico basado en proteína verde fluorescente (GFP) para el ensayo simple y rápido de seroinmunidad provocada por mAb anti-S. y sueros.

El equipo analizó diferentes diseños de vectores de expresión y proporciones óptimas de SARS-CoV-2 M para ensayos de unión celular basados ​​en GFP y evaluó su rendimiento en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) basado en SARS-CoV-2 S. A continuación, el la calidad de VLP se evaluó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), microscopía de epifluorescencia, microscopía confocal (CFM), transferencia Western y análisis de nanoseguimiento (NTA) para evaluar la unión de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) y la similitud con el original SARS-CoV. CoV-2. Además, se examinaron mAbs y sueros de individuos alemanes vacunados utilizando ensayos de inhibición de VLP desarrollados por ellos mismos para evaluar su potencial de inhibición.

Las secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN) que codifican E, M y S del SARS-CoV-2 de la cepa Wuhan-Hu-1 SARS-CoV-2 se insertaron en el vector pOpiE2 y se expresaron transitoriamente en cinco células altas. SARS-CoV-2 M se incorporó a GFP. Para la expresión transitoria en células Expi293F, se introdujo una proteína ACE2 que carece de péptido de señalización (SP) en el vector pCSE2.5.

La expresión de TMPRSS2 se obtuvo reemplazando la mitad del plásmido pCSE2.5-ACE2 con ADN Corona2a1, se realizaron experimentos de transfección, después de lo cual se recogió el sobrenadante que contenía VLP. Además, las VLP se sometieron a análisis de gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), tinción, fluorescencia de gel y análisis de inmunoprecipitación.

Las VLP enriquecidas se analizaron mediante ensayos ELISA sándwich realizados con STE90-C11 como captura de SARS-CoV-2 S RBD y fusión ACE2-mFc soluble para la detección. Relaciones tales como 1:1:1, 1:1:4, 1:1:6 y 1:1:8 para la expresión de S:E:M y VLP-6M-Furin (VLP-6M que carece de Wuhan-Hu- 1 S). ) ha sido evaluado. Las VLP concentradas se transfectaron con células Expi293F que expresan ACE2 y se realizó un análisis de citometría de flujo (FC) para determinar la cantidad de VLP unida a las células Expi293F que expresan ACE2.

consecuencias

Se utilizaron modificaciones directas de la proporción de plásmidos para coexpresar el SARS-CoV-2 E, M y S autoensamblado en VLP. La fusión de proteína M con GFP permitió la cuantificación directa de la inhibición de la unión de ACE2 por mAbs o sueros de individuos vacunados. No se requirieron abs secundarios para la purificación de VLP o el marcaje fluorescente para el análisis de FC. La fusión de proteína SP y M redujo significativamente la señal de unión de VLP en ensayos ELISA tipo sándwich, mientras que la fusión de SP con proteína E mejoró la unión.

Los vectores de expresión VLP codificados como E y S tienen el prefijo SP, mientras que la expresión para M carece de uno. Los análisis ELISA sándwich y FC no mostraron diferencias significativas en la unión de VLP cuando se usaron diferentes proporciones S:E:M, excepto por la ligera unión de VLP-6M-furina. Para los exámenes citológicos posteriores, el equipo seleccionó el VLP-6M. El análisis TEM mostró estructuras virales auténticas similares para VLP y SARS-CoV-2. La cantidad de S presente en la superficie de la VLP se correlaciona con el vector de expresión de S utilizado en los experimentos de transfección celular y da como resultado un halo S típico de VLP-1M, 4M y 6M.

El análisis de NTA mostró un retorno de 10¹³ VLP por litro para todos los VLP, con menor rendimiento (10¹²) para VLP-6M-Furín. El diámetro de partícula promedio para VLP-6M fue de 145 nm (VLP-6M), similar a los CoV (100 a 200 nm). Los análisis de Western blot y SDS-PAGE mostraron la incorporación de M y S (pero no E) en las VLP. Las VLP se observaron como pequeños puntos verdes en las superficies de las células ACE2-TMPRSS2 que expresan células de riñón embrionario humano (HEK) autofluorescentes.

Los números de VLP y las densidades de GFP fueron marginalmente más altos para VLP-6M que para VLP-6M-Furin y variaron según la expresión de ACE2. En el análisis de FC, se observaron diferencias significativas entre los histogramas de VLP y GFP de VLP-6M, ya que se identificaron dos grupos diferentes, uno de los cuales expresaba VLP-6M y ACE2, mientras que el otro no. Por el contrario, para VLP-GM-Furin, se observó un cambio de población, indicativo de una capacidad de unión reducida, como se muestra por ELISA.

Además, los experimentos de optimización mostraron que los ensayos de unión celular se pueden realizar en una hora sin pérdida de señal significativa, y las VLP se pueden almacenar a -80 °C. STE90-C11, STE94-F12, STE94-B1-E12 y STE90-B2-D12 mA (a una concentración de 150 μg/ml) mostraron una inhibición exitosa de la unión de VLP-ACE2 y los resultados de la prueba VLP reflejaron los del SARS- original. Ensayos de neutralización de CoV-2. Se observó una inhibición significativa de la unión a una dilución 1:10 de vacunas triples BNT162b2 en suero.

conclusión

En general, los resultados del estudio demostraron que la producción de VLP de SARS-CoV-2 utilizando un enfoque de transfección directa de plásmidos es una alternativa más simple, rápida y confiable al enfoque BEVS.